Q：培養(yǎng)基 pH 值異常
A：
? 二氧化碳分壓設(shè)置錯(cuò)誤：根據(jù)培養(yǎng)基中碳酸氫鈉的濃度而增加或降低培養(yǎng)箱中二氧化碳分壓。
? 培養(yǎng)箱無二氧化碳：定期觀察二氧化碳?jí)毫Ρ?，及時(shí)更換二氧化碳鋼瓶。
? 細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋擰得過緊：將蓋子旋松 1/4 圈，或換成透氣蓋培養(yǎng)瓶。
? 細(xì)菌、真菌污染 丟棄細(xì)胞和培養(yǎng)基。
? 培養(yǎng)基中的平衡鹽不匹配：二氧化碳平衡環(huán)境中使用以 Earle's 平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hank's 平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基。
? 碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)緩沖能力不足：加入 HEPES 緩沖液，使其終濃度為 10-25 mM。
Q：細(xì)胞生長緩慢
A：
? 培養(yǎng)基或血清改變：比較不同培養(yǎng)基中葡萄糖、氨基酸等成分有無差異；增加細(xì)胞接種密度；更換新鮮培養(yǎng)基。
? 必需生長促進(jìn)成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生長因子 ) 缺乏、耗盡或降解使用新鮮培養(yǎng)基或向現(xiàn)有培養(yǎng)基中添加必需成分。
? 細(xì)胞初始接種密度過低：增大細(xì)胞接種密度。
? 支原體污染：檢測(cè)培養(yǎng)物有無支原體污染，如果被污染，則棄之，或用支原體清除試劑進(jìn)行清除。
? 細(xì)胞代次過高：取用新的細(xì)胞。
? 輕度細(xì)菌或真菌污染：在添加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，如果培養(yǎng)物被污染，則棄之。
試劑儲(chǔ)存不當(dāng)血清應(yīng)置于-5℃至 -20℃下儲(chǔ)存 ；培養(yǎng)基應(yīng)置于 2-8℃下避光儲(chǔ)存；完全培養(yǎng)基應(yīng)置于2-8℃下避光儲(chǔ)存，并限在2周內(nèi)使用。
Q：細(xì)胞死亡
A：
? 胰酶消化過度：縮短胰酶消化時(shí)間或降低消化用胰酶的工作濃度。
? 細(xì)胞狀態(tài)差：取用新的細(xì)胞。
? 支原體污染：檢測(cè)培養(yǎng)物有無支原體污染，如果被污染，則棄之，或用支原體清除試劑進(jìn)行清除。
? 培養(yǎng)基中無附著因子：如采用無血清培養(yǎng)方法，應(yīng)確保其含有附著因子，或使用包被過的培養(yǎng)器皿。
? 培養(yǎng)箱中無二氧化碳：定期觀察二氧化碳?jí)毫Ρ恚皶r(shí)更換二氧化碳鋼瓶。
? 培養(yǎng)箱溫度有波動(dòng)：監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度。
? 轉(zhuǎn)染試劑毒性過強(qiáng)，細(xì)胞代次過高，質(zhì)粒純度差使用低毒性的轉(zhuǎn)染試劑或在轉(zhuǎn)染后及時(shí)換液；使用低代次細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ；使用高品質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
? 細(xì)胞解凍或凍存過程中損傷大：取用新的細(xì)胞。
? 培養(yǎng)基的滲透壓不正確：檢查完全培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可耐受的滲透壓為 260-350 mOsmol/kg，昆蟲細(xì)胞可耐受的滲透壓為 340-380 mOsmol/kg。
? 培養(yǎng)基中有毒代謝產(chǎn)物蓄積過多：更換新鮮培養(yǎng)基。
Q：條帶模糊的原因？
A：
? 電壓過高或電泳時(shí)間過長，產(chǎn)熱過多導(dǎo)致電泳緩沖液溫度升高。建議參照Trans產(chǎn)品使用說明書。
? 電泳緩沖液陳舊，建議使用新鮮的電泳緩沖液，為了獲得理想的結(jié)果建議在使用前預(yù)冷緩沖液。
? 分離膠的濃度偏低，建議使用合適的膠濃度。
? 凝膠放置時(shí)間過長，建議使用新配制的凝膠電泳。
Q： 為什么有時(shí)候帶型不整齊？
A：
? 建議點(diǎn)樣時(shí)將蛋白Marker放在泳道中間。如在凝膠兩側(cè)泳道，由于邊緣效應(yīng)、離子強(qiáng)度不均等原因，均會(huì)導(dǎo)致帶型變寬或彎曲。
? 凝膠配制不勻，凝膠內(nèi)存有氣泡，或點(diǎn)樣孔中有細(xì)碎的殘膠。
Q：電泳時(shí)蛋白Marker分離不開？
A：大多為膠濃度不合適，要在推薦的凝膠濃度范圍內(nèi)使用。此外，比較陳舊的凝膠和緩沖液也會(huì)造成電泳效果不好。
Q：預(yù)染Marker電泳后清晰，但是轉(zhuǎn)膜后顏色很淺？
A：
? 轉(zhuǎn)膜時(shí)一定要將膠和膜壓緊，否則條帶會(huì)在轉(zhuǎn)膜過程中丟失或變淺。
? 轉(zhuǎn)膜條件不適合，建議200 mA、2小時(shí)，或100 mA過夜轉(zhuǎn)膜。
Q：轉(zhuǎn)膜時(shí)甲醇的濃度是多少，會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)膜造成什么影響？
A：甲醇的濃度一般推薦為15%，甲醇濃度太高易造成蛋白穿膜，轉(zhuǎn)移到濾紙上。
Q：發(fā)光液配制需要避光嗎？
A：不需要避光，但是要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后馬上進(jìn)入暗室進(jìn)行下面的操作。
Q：發(fā)光液的有效曝光時(shí)間多長？
A：發(fā)光液在2小時(shí)以內(nèi)均可以曝光，但是前30分鐘曝光能力較強(qiáng)，隨著時(shí)間的推移可適當(dāng)延長曝光時(shí)間來調(diào)節(jié)曝光強(qiáng)度。
Q：曝光后X光片背景很黑是什么原因？
A：背景很黑可能是曝光時(shí)間太長或者顯影時(shí)間過長造成的。
Q：Western Marker 曝光后雜帶很多是什么原因？
A：Marker上樣量過多或曝光時(shí)間過長，可適當(dāng)減少上樣量或曝光時(shí)間。此外，二抗的濃度過高或特異性和純度不高，也會(huì)造成雜帶較多的結(jié)果。
Q：層析柱堵塞？
A：待純化蛋白樣品中存在固體雜質(zhì)，多見于菌體裂解液直接上樣。建議對(duì)樣品微濾 (0.45 μm) 處理。
Q：目的蛋白不與介質(zhì)結(jié)合？
A：
? 目的蛋白沒有 His 標(biāo)簽，其原因可能是載體構(gòu)建有誤、表達(dá)提前終止 (C端融合表達(dá)His 標(biāo)簽)、二級(jí)翻譯起始 (N端融合表達(dá)His標(biāo)簽)等等。建議測(cè)序檢查，或嘗試更換表達(dá)載體。
? His標(biāo)簽折疊在蛋白質(zhì)內(nèi)部沒有暴露。該情況多見于包涵體蛋白在變性條件下的純化。建議充分變性蛋白，可以嘗試使用更強(qiáng)的變性劑 (如用6 M鹽酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶劑 (SDS) 或還原劑 (DTT、β-巰基乙醇) 等方法。
? 緩沖液存在問題。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介質(zhì)純化 His 標(biāo)簽蛋白時(shí)，平衡緩沖液與樣品緩沖液中的某些組分可能會(huì)干擾目的蛋白的結(jié)合。
部分組分建議濃度如下 ：
EDTA: ≤0.1 mM (建議不要使用)
DTT: ≤1 mM (不推薦使用)
β-巰基乙醇: ≤20 mM (慎用)
咪唑: ≤20 mM (因蛋白而異)
Q：洗脫液中雜蛋白多？
A：
? 洗脫條件不合適。建議使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質(zhì)最佳洗脫條件不同，需要摸索優(yōu)化。
? 雜蛋白與介質(zhì)存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入一定濃度的咪唑 (推薦濃度 : ≤20 mM，因蛋白而異)，抑制非特異性結(jié)合。
? 雜蛋白與目的蛋白存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入非離子型去垢劑 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、還原劑 (β- 巰基乙醇 : ≤20 mM） 等組分。
? 目的蛋白降解。建議在低溫下純化目的蛋白，并在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑 (如 PMSF)。
? 存在表達(dá)提前終止 (C 端融合表達(dá) His 標(biāo)簽) 或二級(jí)翻譯起始 (N端融合表達(dá) His 標(biāo)簽)。建議更換表達(dá)載體。
Q：目的蛋白沒有洗脫？
A：
? 目的蛋白量太少，無法檢出。建議更換靈敏度更高的檢測(cè)方法，如用銀染法或 Western Blot 替代考馬斯亮藍(lán)染色，或優(yōu)化上游表達(dá)條件，獲得更多的目的蛋白。
? 目的蛋白沒有結(jié)合介質(zhì)。建議檢測(cè)以下全部樣品以確認(rèn)蛋白：上樣前、流出、洗滌、洗脫。
? 目的蛋白結(jié)合牢固。建議增加洗脫強(qiáng)度，如采用更高濃度的咪唑或更低的 pH 值。
Q：蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？
A：
1、選擇正確的表達(dá)載體與表達(dá)菌株
? T7啟動(dòng)子的載體(如pET系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體 (如Tac啟動(dòng)子的pGEX、pMAL系列表達(dá)載體) 應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。
? 對(duì)細(xì)胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達(dá)低、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。
? 對(duì)于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。
2、嘗試不同的表達(dá)載體與菌株
不同的蛋白，對(duì)不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達(dá)載體。
3、表達(dá)條件的優(yōu)化
? 選擇不同的培養(yǎng)基。對(duì)于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達(dá)量。
? 較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達(dá)時(shí)間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會(huì)降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。
? 細(xì)胞的生長狀態(tài)對(duì)蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過測(cè)量菌液的OD600值監(jiān)測(cè)生長狀態(tài)。對(duì)于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對(duì)數(shù)生長期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導(dǎo)。
Q：目的蛋白不可溶，形成包涵體？
A：
首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。
? 裂解菌體并離心后，通過對(duì)全菌、上清、沉淀的檢測(cè)，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。
? 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
? 目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀?？梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達(dá)時(shí)間、降低誘導(dǎo)時(shí)菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。
Q：目的蛋白大小不正確？
A：
? 蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白分子量大小。
? 確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。
? 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級(jí)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。
RNA純化常見問題解答
Q：提取過程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對(duì)提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對(duì)于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對(duì)上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會(huì)明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會(huì)使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲(chǔ)存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩(wěn)定保存。
Q：提取過程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對(duì)提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對(duì)于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對(duì)上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會(huì)明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會(huì)使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲(chǔ)存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩(wěn)定保存。
Q：產(chǎn)量低
A：
? 檢查細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)條件是否適合質(zhì)粒增殖。盡可能選擇高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
? 如果質(zhì)?？截悢?shù)低，可適當(dāng)增加收集的菌液量，但是要保證菌體可以被完全裂解。
? 如果裂解液過于粘稠，應(yīng)適當(dāng)減少菌體量。
? 培養(yǎng)時(shí)間過長或在 2-8℃保存時(shí)間過長會(huì)明顯降低產(chǎn)量，建議使用新鮮的菌液。
Q：質(zhì)粒 DNA 中有基因組 DNA 污染
A：裂解時(shí)間不宜超過 5 分鐘。
Q：影響下游酶切
A：洗滌液 WB 洗滌后應(yīng)盡量離心去除殘留的液體，待硅膠膜完全干燥后再加入洗脫緩沖液。
Q：DNA 產(chǎn)量低
A：
? 裂解不充分：減少起始材料的用量。檢查樣品中是否加入了 Proteinase K溶液。如果提取的材料為動(dòng)物組織，盡量將組織切碎，并要保證材料完全浸泡在裂解液中。適當(dāng)延長裂解時(shí)間。
? 提取材料質(zhì)量不好：盡量選用新鮮材料，樣品采集后應(yīng)盡快保存在 -70℃或液氮中。DNA 的產(chǎn)量取決于材料的種類和幼嫩程度。
? 離心柱堵塞：過柱前檢查裂解液是否清亮，去除溶液中過于粘稠的不溶物。
? 洗滌溶液中未添加無水乙醇。必須在洗滌溶液中添加合適比例的無水乙醇。
? 洗脫條件不合適：洗脫液 EB 或超純水最好預(yù)先加熱至 70℃，用超純水洗脫前應(yīng)檢查其pH 值是否在 7.0-8.5 之間，如 pH 值小于 7 將明顯影響洗脫效率，需調(diào)節(jié)后再進(jìn)行洗脫。洗脫液應(yīng)盡量加到離心柱的中央，在離心前室溫靜置 1 分鐘。
? DNA 斷裂或降解：避免因移液槍反復(fù)吹吸或反復(fù)凍融樣品造成的 DNA 損傷。避免在操作過程中帶入外源 DNase 污染。
Q：洗脫液顏色發(fā)黑或硅膠膜脫色 ( 動(dòng)物組織或鼠尾材料 )
A：來源于組織的色素大量結(jié)合在離心柱上并與 DNA 一并洗脫：在過柱前檢查是否已加入乙醇，乙醇可防止色素與硅膠膜結(jié)合。在裂解液結(jié)合步驟可適當(dāng)加大轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間。
? RNA 污染：可在樣品材料制備過程中添加適量的 RNase A 降解 RNA。
Q：影響下游的酶切
A：
? 純化的 DNA 中有乙醇?xì)埩簦涸谙礈觳襟E中可能會(huì)帶來乙醇的殘留。加入洗脫液之前將離心柱在最大轉(zhuǎn)速下離心 2-3 分鐘徹底干燥離心柱。
? 純化的 DNA 中有鹽分殘留：采用正確的洗滌操作步驟，用不同 CB 溶液洗滌后再用 WB 洗滌。
Q：如何選擇合適的克隆載體？
A：Taq系列酶擴(kuò)增的片段，選用T載體；Pfu系列酶擴(kuò)增片段，選用Blunt系列載體，也可以加“A”后和T載體連接，但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質(zhì)粒DNA，推薦使用雙抗性載體。
Q：插入片段的量多少合適？
A：
? 片段加入量可根據(jù)片段長度不同進(jìn)行調(diào)整。 最佳插入片段DNA量：載體與片段摩爾比=1:7
? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計(jì)算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)粗定量即可)
? 片段加入量最大為4μl，即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少為0.5μl，可以補(bǔ)充無菌水以方便操作。
? 反應(yīng)溫度范圍：20-37℃，最適反應(yīng)溫度為25℃。
Q：反應(yīng)時(shí)間多長合適？
A：
? 大多數(shù)1 kb以內(nèi)的PCR產(chǎn)物室溫反應(yīng)5分鐘即可完成反應(yīng)。以下幾種情況可以延長反應(yīng)時(shí)間以獲得更理想的效果：
? 具有特殊結(jié)構(gòu)(高AT/高GC/反向重復(fù)序列)的片段：10-20分鐘。
? 膠回收片段或加"A"片段：10-15分鐘(該條件適用于3 kb以內(nèi)的片段)。
? 大于3 kb的PCR產(chǎn)物需延長至15-20分鐘。
Q：連接產(chǎn)物可以保存多久？
A：連接產(chǎn)物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周內(nèi)使用。
Q：多克隆位點(diǎn)上的酶切位點(diǎn)切不開？
A：篩選到的克隆來源于模板質(zhì)粒而不是連接產(chǎn)物。推薦使用雙抗載體，篩選時(shí)使用模板質(zhì)粒不具有的抗性。
Q：克隆數(shù)少或陽性率低？
A：
? 影響克隆數(shù)目和克隆效率的因素有許多，如感受態(tài)細(xì)胞效率、插入片段質(zhì)量、基因結(jié)構(gòu)、插入片段長度、插入片段和載體的比例等。如發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)少或克隆效率低，可嘗試下列方法：
? 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率對(duì)克隆數(shù)有重要影響，轉(zhuǎn)化效率高低與連接產(chǎn)物克隆數(shù)的多少不呈線性關(guān)系。假設(shè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為1×109 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)為1000；轉(zhuǎn)化效率為1×108 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)并不是100，而是低于100。為保證克隆數(shù)，請(qǐng)選用高轉(zhuǎn)化效率的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。
? 使用新鮮的PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物于2-8℃保存，1-2天內(nèi)使用。對(duì)于膠回收產(chǎn)物，應(yīng)盡量縮短紫外照射時(shí)間并適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間 (10-15分鐘)。
? 目的片段濃度極低時(shí)，進(jìn)行濃縮，以保證反應(yīng)時(shí)分子碰撞機(jī)率。
? 毒基因：使用Trans10感受態(tài)細(xì)胞。
? 具有特殊結(jié)構(gòu) (高AT/高GC/反向重復(fù)序列) 的基因：適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間至10-20分鐘。
Q：PCR鑒定重組子失敗？
A：當(dāng)用通用引物鑒定重組子，沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，又沒有載體自連帶，說明PCR失敗。重新優(yōu)化PCR條件或提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒作模板擴(kuò)增或酶切鑒定包含重組子的克隆。
Q：重組克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”？
A：插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框，或插入片段太短 ，這種情況下克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”，可正常鑒定。
Q：電泳條帶模糊?
A：
? 電泳緩沖液緩沖能力差。 電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA條帶遷移的現(xiàn)象。
? 電壓過高，電泳時(shí)間過長。電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過20 V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃。如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA條帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太高易出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。電泳過程中由于會(huì)產(chǎn)熱，因此電泳時(shí)間長容易發(fā)生條帶模糊，特別是小片段會(huì)變得模糊。
? 凝膠放置時(shí)間太長或瓊脂糖的質(zhì)量差，導(dǎo)致DNA 條帶分辨率降低。
Q：DNA Marker 降解?
A：污染了核酸外切酶。建議用滅菌的槍頭，用后及時(shí)將管蓋擰緊。點(diǎn)樣時(shí)勿將電泳緩沖液帶入管中，建議更換槍頭。
Q：用EB瓊脂糖膠電泳不同時(shí)間會(huì)出現(xiàn)條帶亮度變化?
A：由于電泳過程中條帶與EB泳動(dòng)方向相反，結(jié)合EB的量會(huì)隨時(shí)間變化，因此電泳后條帶亮度會(huì)發(fā)生變化。因此建議使用EB染膠實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。
Q：DNA Marker電泳條帶分離效果不好?
A：瓊脂糖制膠濃度不合適，導(dǎo)致分辨率降低。制膠不均勻有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致電泳異常。建議使用新制備的凝膠，制膠時(shí)注意操作中帶來的濃度誤差。一般對(duì)于大分子量片段，低濃度膠分離效果好；對(duì)于小分子量片段，高濃度膠分離效果好。
Q：不同核酸染料對(duì)DNA Marker 遷移率的影響?
A：預(yù)加GeneFinder、GelStain、GoldView到DNA Marker中，對(duì)Marker的遷移率都有一定的影響。
Q：不酶切或酶切不完全
A:
? 酶失活或濃度過低：用已知含目的酶切位點(diǎn)的對(duì)照 DNA 測(cè)試該酶活性；酶應(yīng)貯存于 -20℃，-70℃時(shí)會(huì)凍結(jié)；避免反復(fù)凍融降低酶活；可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)加大酶
量。
? DNA 濃度不合適：推薦 50 μl 反應(yīng)體系酶切 1-2 μg DNA；DNA 過量時(shí)可適當(dāng)增加酶量。
? DNA 被抑制劑污染：與對(duì)照 DNA 樣品一起酶切，驗(yàn)證其是否被抑制；重新純化 DNA 樣品。
? DNA 可能形成超螺旋：不同酶對(duì)超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 消化效率不一樣，可適當(dāng)加大酶量。
? 識(shí)別位點(diǎn)過于接近 DNA 末端：一般在識(shí)別位點(diǎn)兩端各加 6 個(gè)保護(hù)堿基可確保酶切效率。
? 識(shí)別位點(diǎn)不存在：驗(yàn)證 DNA 序列。
? 反應(yīng)條件非最優(yōu)化：緩沖液使用不當(dāng)；按比例使用新鮮緩沖液重復(fù)實(shí)驗(yàn)；按照推薦方案進(jìn)行雙酶切或分步酶切。
? 甲基化封閉酶切位點(diǎn)：PCR 產(chǎn)物未甲基化；使用 dam-/dcm-菌株轉(zhuǎn)化。
Q：出現(xiàn)非預(yù)期帶型
A：
? 確定正確帶型：酶切產(chǎn)物與對(duì)照 DNA 樣品一起電泳，確定是未消化完的底物條帶或者是星號(hào)活性產(chǎn)生的非預(yù)期條帶。
? DNA 樣品污染：重新制備或純化樣品
? 含其它酶切位點(diǎn)：驗(yàn)證 DNA 序列
Q：DNA 電泳呈彌散帶
A：
? 酶與 DNA 結(jié)合緊密未完全解離：使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳；或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。
? 核酸酶污染：制備新的底物樣品；使用新的緩沖液和水。
? 電泳條件不合適：使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠；合適的電流電壓避免過熱。
Q：星號(hào)活性 (特異性降低或改變)
A：
? 高甘油濃度 (>5% v/v)：酶儲(chǔ)存液含 50% 甘油；因此酶量不超過反應(yīng)體積的10%。選擇 50 μl的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以減少反應(yīng)過程中水的蒸發(fā)而提高甘油濃度。
? 非最適緩沖液：盡可能使用推薦緩沖液，離子濃度和 pH 的改變會(huì)引起星號(hào)活性。
? 存在有機(jī)溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等)：確保樣品在制備過程中不含任何有機(jī)物，如 DNA 制備過程中可能混入的乙醇。
? 混有其它二價(jià)離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價(jià)離子
